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      蛋白質在發揮作用時都不是孤立的,而是相互聯系的,蛋白質與蛋白質之間的相互作用構成了細胞生化反應網絡的一個主要組成部分,對調控細胞及其信號有重要意義。蛋白質互作研究按照實驗目的可分為兩大類,一是篩選某個興趣蛋白的互作蛋白,二是驗證兩個蛋白是否存在相互作用。威斯騰生物提供以下多種技術,幫助科研工作者從多個角度解析生物體內的蛋白質相互作用網絡。

      篩選相互作用的蛋白

      技術方法 技術特點 驗證方法 適用樣本
      酵母雙雜交 將報告基因的轉錄因子GAL4基因分成GAD和GBD兩個區域,分別構建對應的兩個融合蛋白GAD-Y和GBD-X,如X和Y有相互作用,將會啟動GAL4基因的表達,進而觀察到報告基因的表達。 報告基因 文庫篩選
      Co-IP-MS 利用二級質譜技術,分離并鑒定Co-IP技術洗脫下來的蛋白質復合物 MS 細胞
      pulldown-MS 利用二級質譜技術,分離并鑒定Pulldown技術洗脫下來的蛋白質復合物 MS 原核表達蛋白、細胞
      蛋白質組芯片 通過誘餌蛋白與芯片上包被的近2萬種背景信息清晰的全長蛋白質進行互作反應,覆蓋81%的人類基因組ORF區。 芯片技術 種屬為人的體外表達蛋白,純化蛋白質
      AP-MS 將親和純化標簽與誘餌蛋白構建成為重組融合蛋白,利用標簽親和純化,并利用二級質譜技術,分離并鑒定洗脫下來的蛋白質復合物 MS 細胞

      Co-IP 免疫共沉淀

      免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質相互作用的經典方法。 是確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。 細胞在非變性條件下被裂解時,細胞內存在的許多蛋白質-蛋白質間的相互作用被保留了下來。當用預先固化在argarose beads或者magnetic beads上的蛋白質A的抗體免疫沉淀A蛋白,那么與A蛋白在體內結合的蛋白質B也能一起沉淀下來。

      Co-IP這種方法常用于測定兩種目標蛋白質是否在體內結合;也可用于篩選一種特定蛋白質的結合蛋白。

      驗證相互作用的蛋白

      技術方法 技術特點 驗證方法 適用樣本
      熒光共定位
      Fluorescence co-localization
      以抗原-抗體反應為基礎,通過熒光標記,直觀展現兩個蛋白在細胞內的結合情況 激光共聚焦顯微鏡拍攝 細胞/組織
      Co-IP-WB 以抗體-抗原反應為基礎,驗證兩個蛋白在細胞內的天然結合 WB 細胞
      pulldown-WB 以標簽蛋白和固相介質的親和作用為基礎,驗證兩個蛋白在體外條件下的結合情況 WB 原核表達蛋白、細胞

      熒光共定位

      熒光共定位(Fluorescence co-localization)是對樣品內兩種熒光標記的信號共同分布的位置進行分析,通常有“基因-標簽”融合蛋白表達和免疫熒光兩種方式。共定位就如字面意思上所說的,只能夠表明蛋白A和B都在此細胞有表達,并且在同樣的細胞內位置/細胞器,是說明兩個蛋白存在直接或間接相互作用的細胞學佐證,這個技術一般用于細胞內輔助證明蛋白相互作用,可以作為其他蛋白質相互作用研究方法的輔助檢測手段。

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