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       免疫組化
                                 免疫組化實驗技術對外服務


      一、免疫組化

                   

      免疫組化是應用免疫學基本原理——抗原抗體反應,即抗原與抗體特異性結合的原理,通過化學反應使標記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色來確定組織細胞內抗原(多肽和蛋白質),對其進行定位、定性及定量的研究,稱為免疫組織化學技術(immunohistochemistry)或免疫細胞化學技術(immunocytochemistry) 


      二、免疫組化步驟:

      1. 洗載玻片:將載玻片置于重鉻酸鉀和濃H2SO4混合液中,目的是為了是載玻片上的硅膠等除去,同時使一些肉眼看不見的凹凸不平的表面變平整,便于組織吸附,然后置于清水中清洗,除去殘余的重鉻酸鉀和濃H2SO4(大約沖一個小時左右),再將載玻片浸泡于酒精之中, 然后放到架子上,置于37°C溫箱中,將多聚賴氨酸涂布于玻片的表面,由于Lys帶正電,而大多數的組織帶負電荷,從而產生吸附作用。

      2. 包埋組織:先在鐵模具中加入一些液態石蠟,先稍微冷卻,然后再將待包埋的組織置于石蠟之中,并排列整齊,再將塑料模具盒蓋上,最后加入少許液體石蠟,進行冷凍,使石蠟變成固態。

      3、切片:將包埋好的組織從模具上取下來,并置于石蠟切片機上,切片機通過調節上下左右來來使組織和切割方向一致,然后調節切片的厚度,一般為5μm,如果比較難切,則可以適當調整厚度,用毛筆將切割的載玻片向外拉,并用小鑷子將包含有完整組織的載玻片置于40°C溫水中。

      4、撈組織:當組織載玻片置于40°C溫水中之前,要先將水浴中的氣泡趕走,以免氣泡受熱上浮而貼到組織上,組織受熱展開,最好是組織不起皺紋,用載玻片撈組織時,一般取載玻片的下1/3或者下1/2一般每種組織撈5-6張,其中2-3張是備用的,每張載玻片上通常撈兩份組織,做對照使用,這樣形成的誤差就比較小了,而且撈載玻片的時候最好方向一致,以便觀察,再將撈出來的載玻片置于架子上,放入37°C溫箱中烘干。
      5、脫蠟:依次將載玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精,起脫蠟作用的主要是二甲苯,依據的是相似相溶的原理.一般在每個試劑中放10min,天氣熱可以少放幾分鐘,相反,天氣較冷的話,就要適當延長脫蠟時間,一般為12-15min.
      6、抗原修復:脫蠟后在清水中沖洗一段時間,加入3%H2O2浸泡10min,從而除去內源性的過氧化氫酶,然后倒掉H2O2,在清水中洗兩次,再加入檸檬酸緩沖液,放入微波爐中蒸煮3min(中火),一般剛到沸騰即可,冷卻至室溫,然后再蒸煮一次,冷卻至室溫,蒸煮的目的是為了使抗原的位點暴露出來。
      7、血清封閉:冷卻至室溫后,將檸檬酸緩沖液倒掉,水洗2次,并將載玻片置于PBS中5min,洗2次,擦干組織周圍的PBS液,馬上加上血清,使一些非特異性的位點封閉起來,然后放入37°C溫箱中半小時。血清稀釋10倍(900μlPBS:100μl血清封閉液)。
      8、加一抗:將溫箱中的載玻片取出,用吸水紙擦干載玻片反面和正面組織周圍的血清,加一抗,如果做對照實驗,就在對照的組織上加PBS。加完一抗后于4°C冰箱中保存過夜。
      9、加二抗:將載玻片從冰箱中取出,放入PBS中洗3次,每次5min,擦干組織周圍的PBS后加上二抗,然后置于37°C溫箱中半小時。
      10、加SABC:將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次,每次5min,擦干組織周圍的PBS后加上SABC, 然后置于37°C溫箱中半小時。SABC稀釋100倍(990μlPBS:10μlSABC)。
      11、加顯色劑:將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次,每次5min,擦干組織周圍的PBS后加上顯色劑。(顯色劑的配置:在1ml水中加1滴顯色劑A,搖勻,然后加1滴顯色劑B,搖勻,再加1滴顯色劑C,搖勻)  A:DAB        B:H2O2        C:磷酸緩沖液
      12、復染:將顯色后的片子用清水沖洗一段時間后,浸泡于蘇木精中染色,一般動物組織為半分鐘,植物組織3-5min。
      13、脫水:將復染后的片子置于水中沖洗后,依次將載玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每個試劑中放置2min,最后浸泡在二甲苯中,搬到通風柜中。

      14、封片:用中性樹膠滴在組織旁邊,再用蓋玻片蓋上,要先放平一側,然后輕輕放下另一側,以免產生氣泡,封好片子后置于通風柜中晾干。


      結果展示:



      威斯騰實驗服務流程:



      威斯騰生物服務項目


      分子生物學檢測蛋白質與免疫學動物實驗
      實時熒光定量PCR單克隆抗體制備帕金森疾病模型
      免疫共沉淀(Co-IP)多克隆抗體制備抑郁癥動物模型
      ELISA(酶聯免疫吸附法)技術Western-blot 實驗服務脊髓損傷模型
      生化指標檢測蛋白雙向電泳實驗服務腦外損傷模型
      雙熒光素酶報告基因檢測原核蛋白表達純化骨神經損傷模型
      染色質免疫共沉淀(ChIP)真核蛋白表達純化心肌缺血模型
      GST pull DownITRAQ定量蛋白質組學心力衰竭模型
      SLAC蛋白組學肺動脈高血壓動物模型
      高血壓模型
      病毒包裝純化實驗課題整體外包粥樣動脈硬化模型
      過表達/干擾慢病毒包裝純化整體課題外包大腦中動脈阻塞模型
      過表達/干擾腺病毒包裝純化細胞整體實驗外包慢性之氣管炎模型
      逆轉錄病毒包裝純化動物整體實驗外包過敏性哮喘模型
      腺相關病毒包裝純化肺炎大鼠模型
      肝炎-肝硬化-肝癌模型
      蛋白芯片原代細胞培養肝纖維化模型
      細胞因子芯片骨髓間充質干細胞培養膽結石模型
      生長因子芯片脂肪干細胞培養急性胰腺炎模型
      信號通路磷酸化水平檢測芯片心肌成纖維細胞培養急性腎衰竭模型
      BioPlex懸浮芯片軟骨細胞培養體內血栓模型
      生長因子芯片血管內皮細胞培養關節炎模型
      炎癥因子芯片神經元細胞培養I型和II型糖尿病模型
      血管生成因子芯片內皮組細胞原代培養裸鼠成瘤
      凋亡因子芯片基因編輯動物
      趨化因子芯片電生理相關服務動物整體實驗服務
      HuProt TM 20K人類蛋白組芯片膜片鉗實驗
      細胞生物學高通量測序代謝組學
      細胞原代培養mRNA測序氣相色譜GC/MS
      MTT檢測LncRNA測序液相色譜LC/MS
      細胞凋亡檢測全基因組測序核磁共震NMR
      細胞周期檢測RNA-Seq測序
      細胞克隆形成實驗外顯子測序影像學相關實驗
      Transwell細胞遷移/侵襲16s擴增子測序Micro-CT
      流式分選Small RNA測序小動物活體成像
      CCK8/XTT檢測宏基因組測序核磁共振
      臺盼藍檢測細胞活性單細胞測序PET-CT
      藥物篩選細胞學實驗circleRNA測序
      細胞粘附性檢測甲基化測序基因編輯動物
      細胞劃痕實驗條件性敲除小鼠/大鼠
      細胞生物學整體實驗全基因敲除小鼠/大鼠
      細胞成管實驗
      病理學檢測CRISPR/Cas9細胞敲除/敲入基因芯片
      掃描電鏡基因定點突變細胞系LncRNA芯片
      透射電鏡單基因敲除細胞系miRNA芯片
      HE染色多基因敲除細胞系mRNA芯片
      免疫組化目的基因敲入細胞系甲基化芯片(限人和小鼠來源樣本)
      Tunel(原位末端凋亡法)檢測報告基因敲入細胞系SNP芯片(限人和小鼠來源樣本)
      激光共聚焦miRNA/LncRNA敲除細胞系
      免疫熒光
      Masson染色CRISPR/Cas9動物敲除/敲入科研方案設計與SCI相關服務
      原位雜交基因敲除大鼠/小鼠科研文獻論著翻譯
      熒光原位雜交基因敲入大鼠/小鼠SCI論文翻譯潤色服務
      特殊染色(PSA、茜素紅、阿爾新藍等)臨床實驗/科研實驗設計方案指導
      行為學檢測藥物篩選服務項目藥效學評價
      水迷宮實驗高通量自動藥物篩選平臺神經系統藥物藥效學評價
      曠場實驗細胞高內涵藥物篩選平臺抗腫瘤藥物藥效學評價
      重復性刻板行為檢測蛋白質組學靶標研發平臺心血管系統藥物藥效學評價
      動物跑臺檢測分子藥理研究平臺泌尿系統藥物藥效學評價
      強迫游泳生物膜片鉗藥物篩選平臺內分泌系統藥物藥效學評價
      常規藥物體外篩選抗炎免疫藥物藥效學評價


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