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       SNP篩查和鑒定——DHPLC法


      SNP
      篩查和鑒定——DHPLC
       


      簡介:
      人類基因組中存在著廣泛的多態性,最簡單的多態形式是發生在基因組中的單個核苷酸的替代,即單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms, SNP)。SNP的數量大、分布廣,在組成人類基因組30億個堿基中,平均每1000個就有一個SNPSNP作為第三代遺傳標記,在復雜疾病的基因定位、關聯分析、個體疾病易感性分析與藥物基因組學的研究中發揮著愈來愈重要的作用。為適應日益增長的 SNP研究需求,和各類客戶的不同需要,威斯騰生物中心利用多套技術方案為不同客戶提供量身定做的個性化服務。


       

      DHPLC高端變性高壓液相色譜)法:

       

      特點:

      1、擁有高端變性高壓液相色譜儀(WAVE 3500HT)等儀器設備,配備有國內領先和國際一流水平的研究隊伍。

      2、采用DNA樣品池法(將若干份PCR樣品混合在一起),使得純合突變也能以雜合子形式得以撿出,極大提高了尋找未知SNPs的效率。

      3、  具有高通量檢測、自動化程度高、靈敏度和特異性較高、檢測DNA片段和長度變動范圍廣、相對價廉等優點

      4、  檢測所需的樣品量很少,PCR產物高于80ng就能滿足實驗要求,且無需純化,實驗重復性好

      5、  上機時間短,只需5~6min就可得出數據

      6、  根據峰圖可判斷是否有突變,但不能確定SNP的位置和類型,需用標準樣品或結合測序驗證


      原理:

      DHPLC基因突變篩查,就是利用離子對反向液相色譜技術,通過獨特的DNA分離基質,對特定的PCR反應產物進行分離。含有突變位點的PCR擴增產物經變性、逐步降溫退火后,將形成同源和異源雙鏈(一條為突變鏈,另一條為正常鏈)兩種DNA分子.在部分變性條件下,發生錯配的異源雙鏈DNA更易于解鏈為單鏈DNA,與DNAsep柱結合力降低,比同源雙鏈DNA分子更易于被乙腈洗脫下來,從而與同源雙鏈DNA分離.一般來說,含變異成分的PCR產物將在DHPLC圖譜上比PCR非變異產物多1-2個峰型,因而兩者可以被鑒別.

      實驗流程:

      1DNA提取,設計引物并合成

      2PCR

      3、上機檢測,數據采集以及分析

       

      客戶需知:

      1準確的基因名稱和序列以及SNP位點信息

      2A、組織或血液樣品B、基因組DNA 樣品,需-20度保存和運輸

      3、純度要求:OD260/2801.6~1.8之間;OD260/2301.8~2.2之間

      4、濃度要求( C) :基因組DNA濃度大于100ng/μl    

      5DNA用量需求( UL):PCR反應個數(N* M/ C

      6、單個PCR反應量(M)50ng

      7PCR產物大小在150~800bp之間,最好在300bp左右,里面不含礦物油、甲酰胺、高壓滅菌水、蛋白酶 K、牛血清白蛋白

      8、為了提高 PCR 擴增的保真性,最好選用 Pfu DNA 聚合酶

       

      結果提供:

      1、提供每個PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖片

      2、提供電子版結果及實驗流程

      3、提供數據分析服務

      4、實驗數據及實驗剩余的樣品和引物為客戶所有

       

      實驗費用:

      1、   DNA提取費用

      2、   引物設計及合成費用

      3、   PCR擴增費用

      4、   上機費用

      5、   數據分析費用


      附:HPLC其他應用領域

      工作模式

      溫度范圍

      應用范圍

      分離原理

      非變性

      50

      鑒定雙鏈DNA片段長度(小于2000bp

      按片段長度分離,與序列無關

      PCR產量檢查和產物純化

      定量分析(Q-RT-PCR

      部分變性

      52-75

      (平均范圍)

      突變檢測

      依靠片段大小和序列分離

      單核苷酸多態性(SNP)研究

      完全變性

       

      75-80

      (平均范圍)

       

      鑒定單鏈DNA片段長度(小于2000bp

      依靠片段大小和序列分離

      RNA分析 (用RNASep柱)

      寡核苷酸分析(DNASep柱與OLIGOSep 柱)和純化(片段收集器)。大量純化需用OLIGOSepPrepTM HC



      威斯騰實驗服務流程




      威斯騰實驗服務項目




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