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        Western Blot檢測

       

            Western Blotting實驗技術對外服
      一、 威斯騰生物|WB技術服務簡介:


      免疫印跡(immunoblotting)又稱蛋白質印跡(Western blotting),它是根據抗原抗體的特異性結合檢測復雜樣品中某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術基礎上發展起來的一種新的免疫生化技術。由于免疫印跡具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性,現已成為蛋白分析的一種常規技術。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白,并能對蛋白進行定性和半定量分析。


      二、威斯騰生物|WB實驗儀器:

        

      高速組織搗碎機: SWISS KINEMATIC Ltd. Co(型號:PT1600E

      電泳儀:北京六一儀器廠(型號:DYY-8C

      電泳槽:北京六一儀器廠(型號:DYCZ-24D)    

      轉印槽:北京六一儀器廠(型號:DYCZ-40D)

      低溫高速離心機:湖南湘儀公司(型號:H2050R)

      超低溫冰箱:美國FORMA公司(型號:702

      分光光度計:上海分析儀器總廠(型號:721)

      脫色搖床:上海琪特分析儀器有限公司(型號:STS-2)


      三、WB技術操作步驟:


      樣品準備

      1)分別取大約200mg組織加入液氮碾磨成粉末狀,按每200mg組織加900μl上樣Buffer(無溴酚藍)100ul 10mg/ml PMSF,混勻,玻璃勻漿器冰點勻漿;

      2412000rpm離心10min;

      3)取上清夜-70凍存24hr;

      44 12000rpm再次離心10min,取上清分裝,一份用于定蛋白,另一份加入溴酚藍(0.1%(W/V))后于100加熱4min,后于-20保存待用。


      定蛋白及計算電泳上樣量

      根據總蛋白測定試劑盒說明書操作測定樣本中的總蛋白含量,電泳上樣量定為40ug


      電泳

      1)安裝好電泳裝置;

      2)根據不同的指標配制相應濃度的分離膠,灌膠約3/5體積,液封(<10%0.1%SDS,>10%用異丙醇);

      330min后,待凝后傾去封液;

      4)配5%的濃縮膠,灌膠至距平板頂部2mm處,插入梳子, 30min后,待凝后拔出梳子,用去離子水清洗加樣孔,用濾紙吸干;

      5)上樣:各樣品取50ug上樣,marker10μl上樣(上樣前需按說明書進行預處理);

      6)緩慢加入內、外槽緩沖液,接通電源,90v電泳至指示劑進入分離膠后,調電壓至150V繼續電泳;

      7)當指示劑距平板底端1cm處時停止電泳;


      轉膜及檢測

      1)準備212cm的平面皿,一個裝去離子水浸泡NC20min,另一裝轉移緩沖液浸泡海綿和濾紙20min;

      2)取下膠,切除濃縮膠部分后,將分離膠浸入轉移緩沖液中約5min;

      3)按順序安裝好轉膜裝置(黑色板-海綿-三層濾紙-凝膠-硝酸纖維膜-三層濾紙-海綿-紅色板);

      4)完全排除氣泡, 4,100mA轉膜2h;

      5)傾去轉膜緩沖液,拆除轉膜裝置,將硝酸纖維膜放入麗春紅中搖床染色15min,用去離子水清洗至能看到條帶,后用鉛筆標出marker位置,再用去離子水震蕩以去除浮色。在右上角剪去一角以辨上下左右;

      6)將膜轉移至另一容器中,用5%脫脂奶粉封閉4過夜;

      7)將膜轉移至盡可能小的容器中并加入稀釋好的一抗;

      837搖床孵育約2h;

      9PBST洗滌4次,每次5min;

      10)將膜轉移至盡可能小的容器中并加入稀釋好的二抗,37搖床孵育約30min;

      11PBST洗滌4次,每次5min;

      12)將膜轉移至盡可能小的容器中并加入BCIP/NBT底物,室溫孵育30min;

      13)取出NC膜,用蒸餾水漂洗后晾干;

      14)掃描及分析。


      四、威斯騰生物|WB服務要求:

      1、樣本要求:組織樣品,每份樣本約250-500mg,新鮮或正確保存的組織。細胞樣本:每份樣本:1*10 61*10 7細胞數。

      2、客戶提供有效的一抗,(國產抗體一般不接納) 一抗自備或代購。

      3、客戶提供欲檢測目的蛋白的詳細背景資料。以及提供樣本的種屬,類型。


      五、威斯騰生物|WB服務結果提供:
      1、目的蛋白實驗圖片。

      2、灰度分析結果。(免費分析)

      3、內參結果。(免費跑膠)

      4、詳細的實驗步驟。

      5、免費提供蛋白樣本保存液。


      六、威斯騰生物|WB實驗周期


      接受樣本后,1-2個月。


      七、威斯騰生物|WB實驗注意事項:


      1
      、客戶要確保檢測樣本沒有問題。

      2、客戶要確保抗體的有效性。

      3、實驗周期比較緊張的客戶需特別說明。

      4、收費標準:以每張膜8個樣本收費,不足8個樣本的按8個樣本收費)


      八、威斯騰生物服務流程:




      九、威斯騰生物服務項目


      分子生物學檢測蛋白質與免疫學動物實驗
      實時熒光定量PCR單克隆抗體制備帕金森疾病模型
      免疫共沉淀(Co-IP)多克隆抗體制備抑郁癥動物模型
      ELISA(酶聯免疫吸附法)技術Western-blot 實驗服務脊髓損傷模型
      生化指標檢測蛋白雙向電泳實驗服務腦外損傷模型
      雙熒光素酶報告基因檢測原核蛋白表達純化骨神經損傷模型
      染色質免疫共沉淀(ChIP)真核蛋白表達純化心肌缺血模型
      GST pull DownITRAQ定量蛋白質組學心力衰竭模型
      SLAC蛋白組學肺動脈高血壓動物模型
      高血壓模型
      病毒包裝純化實驗課題整體外包粥樣動脈硬化模型
      過表達/干擾慢病毒包裝純化整體課題外包大腦中動脈阻塞模型
      過表達/干擾腺病毒包裝純化細胞整體實驗外包慢性之氣管炎模型
      逆轉錄病毒包裝純化動物整體實驗外包過敏性哮喘模型
      腺相關病毒包裝純化肺炎大鼠模型
      肝炎-肝硬化-肝癌模型
      蛋白芯片原代細胞培養肝纖維化模型
      細胞因子芯片骨髓間充質干細胞培養膽結石模型
      生長因子芯片脂肪干細胞培養急性胰腺炎模型
      信號通路磷酸化水平檢測芯片心肌成纖維細胞培養急性腎衰竭模型
      BioPlex懸浮芯片軟骨細胞培養體內血栓模型
      生長因子芯片血管內皮細胞培養關節炎模型
      炎癥因子芯片神經元細胞培養I型和II型糖尿病模型
      血管生成因子芯片內皮組細胞原代培養裸鼠成瘤
      凋亡因子芯片基因編輯動物
      趨化因子芯片電生理相關服務動物整體實驗服務
      HuProt TM 20K人類蛋白組芯片膜片鉗實驗
      細胞生物學高通量測序代謝組學
      細胞原代培養mRNA測序氣相色譜GC/MS
      MTT檢測LncRNA測序液相色譜LC/MS
      細胞凋亡檢測全基因組測序核磁共震NMR
      細胞周期檢測RNA-Seq測序
      細胞克隆形成實驗外顯子測序影像學相關實驗
      Transwell細胞遷移/侵襲16s擴增子測序Micro-CT
      流式分選Small RNA測序小動物活體成像
      CCK8/XTT檢測宏基因組測序核磁共振
      臺盼藍檢測細胞活性單細胞測序PET-CT
      藥物篩選細胞學實驗circleRNA測序
      細胞粘附性檢測甲基化測序基因編輯動物
      細胞劃痕實驗條件性敲除小鼠/大鼠
      細胞生物學整體實驗全基因敲除小鼠/大鼠
      細胞成管實驗
      病理學檢測CRISPR/Cas9細胞敲除/敲入基因芯片
      掃描電鏡基因定點突變細胞系LncRNA芯片
      透射電鏡單基因敲除細胞系miRNA芯片
      HE染色多基因敲除細胞系mRNA芯片
      免疫組化目的基因敲入細胞系甲基化芯片(限人和小鼠來源樣本)
      Tunel(原位末端凋亡法)檢測報告基因敲入細胞系SNP芯片(限人和小鼠來源樣本)
      激光共聚焦miRNA/LncRNA敲除細胞系
      免疫熒光
      Masson染色CRISPR/Cas9動物敲除/敲入科研方案設計與SCI相關服務
      原位雜交基因敲除大鼠/小鼠科研文獻論著翻譯
      熒光原位雜交基因敲入大鼠/小鼠SCI論文翻譯潤色服務
      特殊染色(PSA、茜素紅、阿爾新藍等)臨床實驗/科研實驗設計方案指導
      行為學檢測藥物篩選服務項目藥效學評價
      水迷宮實驗高通量自動藥物篩選平臺神經系統藥物藥效學評價
      曠場實驗細胞高內涵藥物篩選平臺抗腫瘤藥物藥效學評價
      重復性刻板行為檢測蛋白質組學靶標研發平臺心血管系統藥物藥效學評價
      動物跑臺檢測分子藥理研究平臺泌尿系統藥物藥效學評價
      強迫游泳生物膜片鉗藥物篩選平臺內分泌系統藥物藥效學評價
      常規藥物體外篩選抗炎免疫藥物藥效學評價

       


      【本平臺合作項目】
      分子生物學、細胞生物學、基因敲出/入、模式動物、SPF動物保種、病理學檢測、免疫學檢測、影像學檢測、原代培養、細胞藥篩、CRISPR/Cas9基因編輯、基因芯片、高通量測序、蛋白組學、代謝組學、高通量高內涵篩選、藥效學評價、藥理毒理學實驗、慢病毒包裝與穩轉株建立、SiRNA與納米載藥、ChIP、CO-IP、生物信息學分析、知識產權服務! 
      【全國免費熱線】400-675-6758
      【電話】 023-65316016,023-65316556
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      【地址】 重慶市高新區二郎創業大道高科創業園D棟2樓
        

       

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