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       MTT/CCK8/XTT檢測

      MTT/CCK8/XTT檢測

      一、實驗介紹

      (a) MTT

      MTT為黃色化合物,是一種接受氫離子的染料。活細胞在琥珀酸脫氫酶和細胞色素c的作用下四唑環開裂,生成藍色的甲月替結晶并沉積在細胞中,甲月替結晶的生成量僅僅與活細胞數目成正比(死細胞中的琥珀酸脫氫酶消失,不能還原MTT)。還原生成的甲月替結晶可在含50%N,N-二甲基甲酰胺、20%的十二甲基磺酸鈉(PH 4.7)或10%酸化十二甲基磺酸鈉(PH 4.7)的溶液中溶解。利用酶標儀測定490nm波長處的光密度測出OD值,即反映活細胞數目。也可利用DMSO(二甲基亞砜)來溶解。用DMSO之前要盡量去掉培養液,一遍DMSO溶解甲月替顆粒,進行比色測定。

      1.取96孔細胞培養板,每孔中加0.1ml2×10410×104靶細胞的培養液(含10%小牛血清的RPMI-1640培養液),在37 5 CO2的飽和水汽二氧化碳培養箱中培養23小時讓細胞帖壁(如果是懸浮細胞可直接進行下一步)

      2.用RPMI-1640培養液210倍遞次稀釋細胞因子標準品,根據情況25倍遞次稀釋待檢樣品,每孔加0.1ml稀釋的標準品和待檢樣品,每個稀釋度3個重復孔。對照孔6個:3個陽性對照孔,每孔加0.1ml含大劑量細胞因子的RPMI-1640培養液,3個陰性對照孔,每孔加0.1ml RPMI-1640培養液。在37 5 CO2的飽和水汽二氧化碳培養箱中培養2448小時或預定的時間。

      3.吸去培養液,用PBS洗滌一次(如為懸浮細胞,應在吸去上清液前離心培養板)。

      4.每孔加0.1ml PBS10μl MTT染液,在37 5 CO2的飽和水汽二氧化碳培養箱中培養46小時。

      5.每孔加0.1ml酸化異丙醇,也可用含10 SDS10mmol/L HCl代替酸化異丙醇,在振蕩器上振蕩混勻,讓還原產物充分溶解。置酶聯檢測儀上測定光密度(OD)值,檢測波長570nm,參考波長630nm。以OD值對樣品稀釋度作圖,比較標準曲線和待測樣品曲線即可求得待測樣品中細胞因子的含量。


      (b) CCK-8檢測細胞增殖(活力):

      CCK-8cell-counting kit-8)檢測試劑盒是應用WST-8取代MTT被還原,WST-8是一種類似于MTT的化合物,在電子耦合試劑存在的情況下,可以被線粒體內的一些脫氫酶還原生成橙黃色的formazanWST-8產生的formazanXTTMTS產生的formazan更易溶解。且WST-8相較XTTMTS化學性狀更穩定, 因此實驗結果相對更加穩定。此外,WST-8相較MTTXTT,線性范圍相對寬,靈敏度更高。 

      當細胞增殖得越多越快,則formazan產生量越多,顏色越深;反之,當內外因造成的細胞毒性越大,則顏色越淺。對于同樣的細胞,顏色的深淺和細胞數目呈線性關系。應用酶標儀測定吸光值并進行統計學計算便可以獲得細胞增殖(活性)相關數據。


      (c) XTT

      化學名:2,3- bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl] -2H-tetrazolium hydroxide,作為線粒體脫氫酶的作用底物,被活細胞還原成水溶性的橙黃色產物。當XTT與電子偶合劑(例如PMS)聯合應用時,其所產生的水溶性的產物的吸光度與活細胞的數量成正比。用XTT代替MTT可省去溶解還原產物結晶的步驟,XTT可以被活細胞中的代謝酶還原成黃色水溶性的代謝產物(formazan)。代謝產物在OD450處有吸收峰。優點:1、使用方便,省去了洗滌細胞;2、檢測快速;3、靈敏度高,甚至可以測定較低細胞密度;4、重復性優于MTT。 缺點:XTT水溶液不穩定,需要低溫保存或現配現用。


      二、應用范圍

      生物活性因子的活性檢測;

      大規模的抗腫瘤藥物篩選;

      細胞增殖實驗;

      藥物或基因導致的細胞毒性試驗;

      藥敏試驗等。

       

      三、服務周期

      15-25個工作日


      四、服務流程




      威斯騰生物服務項目


      分子生物學檢測蛋白質與免疫學動物實驗
      實時熒光定量PCR單克隆抗體制備帕金森疾病模型
      免疫共沉淀(Co-IP)多克隆抗體制備抑郁癥動物模型
      ELISA(酶聯免疫吸附法)技術Western-blot 實驗服務脊髓損傷模型
      生化指標檢測蛋白雙向電泳實驗服務腦外損傷模型
      雙熒光素酶報告基因檢測原核蛋白表達純化骨神經損傷模型
      染色質免疫共沉淀(ChIP)真核蛋白表達純化心肌缺血模型
      GST pull DownITRAQ定量蛋白質組學心力衰竭模型
      SLAC蛋白組學肺動脈高血壓動物模型
      高血壓模型
      病毒包裝純化實驗課題整體外包粥樣動脈硬化模型
      過表達/干擾慢病毒包裝純化整體課題外包大腦中動脈阻塞模型
      過表達/干擾腺病毒包裝純化細胞整體實驗外包慢性之氣管炎模型
      逆轉錄病毒包裝純化動物整體實驗外包過敏性哮喘模型
      腺相關病毒包裝純化肺炎大鼠模型
      肝炎-肝硬化-肝癌模型
      蛋白芯片原代細胞培養肝纖維化模型
      細胞因子芯片骨髓間充質干細胞培養膽結石模型
      生長因子芯片脂肪干細胞培養急性胰腺炎模型
      信號通路磷酸化水平檢測芯片心肌成纖維細胞培養急性腎衰竭模型
      BioPlex懸浮芯片軟骨細胞培養體內血栓模型
      生長因子芯片血管內皮細胞培養關節炎模型
      炎癥因子芯片神經元細胞培養I型和II型糖尿病模型
      血管生成因子芯片內皮組細胞原代培養裸鼠成瘤
      凋亡因子芯片基因編輯動物
      趨化因子芯片電生理相關服務動物整體實驗服務
      HuProt TM 20K人類蛋白組芯片膜片鉗實驗
      細胞生物學高通量測序代謝組學
      細胞原代培養mRNA測序氣相色譜GC/MS
      MTT檢測LncRNA測序液相色譜LC/MS
      細胞凋亡檢測全基因組測序核磁共震NMR
      細胞周期檢測RNA-Seq測序
      細胞克隆形成實驗外顯子測序影像學相關實驗
      Transwell細胞遷移/侵襲16s擴增子測序Micro-CT
      流式分選Small RNA測序小動物活體成像
      CCK8/XTT檢測宏基因組測序核磁共振
      臺盼藍檢測細胞活性單細胞測序PET-CT
      藥物篩選細胞學實驗circleRNA測序
      細胞粘附性檢測甲基化測序基因編輯動物
      細胞劃痕實驗條件性敲除小鼠/大鼠
      細胞生物學整體實驗全基因敲除小鼠/大鼠
      細胞成管實驗
      病理學檢測CRISPR/Cas9細胞敲除/敲入基因芯片
      掃描電鏡基因定點突變細胞系LncRNA芯片
      透射電鏡單基因敲除細胞系miRNA芯片
      HE染色多基因敲除細胞系mRNA芯片
      免疫組化目的基因敲入細胞系甲基化芯片(限人和小鼠來源樣本)
      Tunel(原位末端凋亡法)檢測報告基因敲入細胞系SNP芯片(限人和小鼠來源樣本)
      激光共聚焦miRNA/LncRNA敲除細胞系
      免疫熒光
      Masson染色CRISPR/Cas9動物敲除/敲入科研方案設計與SCI相關服務
      原位雜交基因敲除大鼠/小鼠科研文獻論著翻譯
      熒光原位雜交基因敲入大鼠/小鼠SCI論文翻譯潤色服務
      特殊染色(PSA、茜素紅、阿爾新藍等)臨床實驗/科研實驗設計方案指導
      行為學檢測藥物篩選服務項目藥效學評價
      水迷宮實驗高通量自動藥物篩選平臺神經系統藥物藥效學評價
      曠場實驗細胞高內涵藥物篩選平臺抗腫瘤藥物藥效學評價
      重復性刻板行為檢測蛋白質組學靶標研發平臺心血管系統藥物藥效學評價
      動物跑臺檢測分子藥理研究平臺泌尿系統藥物藥效學評價
      強迫游泳生物膜片鉗藥物篩選平臺內分泌系統藥物藥效學評價
      常規藥物體外篩選抗炎免疫藥物藥效學評價

       

      【本平臺合作項目】

      分子生物學、細胞生物學、病理染色檢測、細胞敲除&敲入、模式與轉基因動物、SPF動物保種、免疫學檢測、影像學檢測、原代培養、細胞藥篩、CRISPR/Cas9基因編輯、基因芯片、高通量測序、蛋白組學、代謝組學、高通量高內涵篩選、藥效學評價、藥理毒理學實驗、慢病毒包裝與穩轉株建立、SiRNA與納米載藥、ChIP、CO-IP、生物信息學分析、知識產權服務!

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