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       心肌成纖維細胞(CFs)原代培養


      心肌成纖維細胞(CFs)原代培養

      一、實驗動物

      清潔級SD大鼠乳鼠,若干,購于第三軍醫大學動物實驗中心

      二、主要儀器

      80/150/200目不銹鋼細胞篩

      (上海生工,中國)

      小型臺式離心機

      (TGL-16G,中國)

      電子分析天平

      (Precisa12A,瑞士)

      千分之一電子天平

      (GB303 Mettler-Toledo Instr. Ltd)

      移液器

      (eppendorf,德國)

      電熱恒溫水浴箱

      (DK-8D,中國)

      旋渦振蕩器

      (QL-901,中國)

      光學倒置顯微鏡

      (Olympus AX70,日本)

      隔水式電熱恒溫培養箱

      (XMTH-142,中國)

      細胞培養箱

      (Shellab,美國)

      超凈工作臺

      (VS-1300,中國蘇州)

      純水儀

      高壓滅菌鍋

      臺式水浴恒溫振蕩搖床  SHZ-88

         0.22um纖維素濾膜       

      0.45um混合纖維素濾膜

      細胞培養瓶及細胞培養板

      細胞計數板   

      (MILLIPORE,德國)

      (上海賽洋,中國)

      (江蘇太倉市實驗設備廠,中國)

      (BM,德國)

      (BM,德國)

      (Costar,美國)

      (上海醫用儀器廠,中國)

      三、主要試劑配制

      (1)PBS:用購自中山公司的PBS粉劑,每袋加ddH2O定容至1000ml,調pH7.2,高壓滅菌消毒。

      (2) 0.25%胰蛋白酶消化液:使用時濃度為0.25%,含0.02%EDTA,制備時即取250mg胰酶和20mgEDTA溶于100mLPBS溶液,并在無菌操作臺上用0.22um一次性過濾器過濾,50ml分裝,4℃保存。

      (3) DMEM-F12細胞生長培養液:臨用前根據需要加10%胎牛血清,1%的ITS,最后按1%體積分數加入雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素),使青霉素和鏈霉素的終濃度分別為100 U/mL和100 U/mL,置于4℃冰箱保存。

      (4)抗生素:青霉素(80萬U)和鏈霉素(100萬U)在無菌操作臺內以高壓滅菌過的雙蒸水溶解(分別加入4ml滅菌水/青霉素,5ml滅菌水/鏈霉素),配制成20萬u/ml分裝,置于-20℃冰箱保存,臨用時4℃解凍,注意盡量避免反復凍融,并使培養基最終濃度為100 u/ml。

      (5)細胞凍存液:生長培養基(含20%胎牛血清)或100%胎牛血清,加入10%的DMSO混合均勻,置于4℃冰箱保存。

      四、細胞操作實驗方法

      1、細胞生長培養基的制備

      培養基在使用前需加入一定量的小牛血清或胎牛血清和雙抗,一般為10%~20%血清。培養基分裝成小瓶(100~200 mL)以便使用,翻帽塞塞緊瓶口。 按細胞生長需求,制備相應的生長培養基。一般的細胞生長培養基為培養基+10%胎牛血清+1%ITS,最后按1%體積分數加入雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素),使青霉素和鏈霉素的終濃度分別為100 U/mL和100 U/mL。

      2、大鼠心肌成纖維細胞原代分離培養

      1)將SD乳鼠在75%酒精中浸泡1-5min,然后固定在泡沫板上,先用碘酒消毒胸腹部,再用酒精消毒。取出無菌剪刀和鑷子,先用酒精棉球再次消毒,剪開胸,取心尖部位,快速置于含雙抗的預冷的PBS溶液潤洗3遍。

      2)剔除周圍結締組織,將心臟置于無菌平皿中,將心臟盡量剪碎,平皿內加入適量0.125%的胰酶,在37度培養箱中,采用分次消化,每次消化5分鐘,一共消化8~10次。

      3)每次消化后取上清液,并加入等量的含10%的DMEM/F12培養基,輕輕混勻,中和胰酶的消化,防止消化多度。用100目細胞過濾篩子過濾含細胞的混合液,最后將過濾后的細胞懸液1000R/MIN離心5分鐘。離心后收集沉淀,用PBS再次重復離心3次。用細胞培養基將細胞沉淀重懸。于細胞培養瓶中培養。

      4)在培養90分鐘左右,將未貼壁的細胞懸液吸出。此時已經貼壁的是心肌成纖維細胞,加入DMEM/F12培養基,放入培養瓶繼續培養。

      5)24h換液,并每日觀察心肌成纖維細胞的生長。

      五、無菌操作注意事項

      細胞培養一定要保持工作區的無菌清潔,先用紫外燈和臭氧殺菌1h,然后通風30min,操作前需要換細胞間專用拖鞋,雙手帶上一次性橡膠手套并用75%乙醇消毒,穿上實驗服,戴上一次性口罩和帽子,操作時不能大聲說話,整個無菌操作都應該在酒精燈的周圍進行。

      服務流程




      威斯騰生物服務項目

      分子生物學檢測蛋白質與免疫學動物實驗
      實時熒光定量PCR單克隆抗體制備帕金森疾病模型
      免疫共沉淀(Co-IP)多克隆抗體制備抑郁癥動物模型
      ELISA(酶聯免疫吸附法)技術Western-blot 實驗服務脊髓損傷模型
      生化指標檢測蛋白雙向電泳實驗服務腦外損傷模型
      雙熒光素酶報告基因檢測原核蛋白表達純化骨神經損傷模型
      染色質免疫共沉淀(ChIP)真核蛋白表達純化心肌缺血模型
      GST pull DownITRAQ定量蛋白質組學心力衰竭模型
      SLAC蛋白組學肺動脈高血壓動物模型
      高血壓模型
      病毒包裝純化實驗課題整體外包粥樣動脈硬化模型
      過表達/干擾慢病毒包裝純化整體課題外包大腦中動脈阻塞模型
      過表達/干擾腺病毒包裝純化細胞整體實驗外包慢性之氣管炎模型
      逆轉錄病毒包裝純化動物整體實驗外包過敏性哮喘模型
      腺相關病毒包裝純化肺炎大鼠模型
      肝炎-肝硬化-肝癌模型
      蛋白芯片原代細胞培養肝纖維化模型
      細胞因子芯片骨髓間充質干細胞培養膽結石模型
      生長因子芯片脂肪干細胞培養急性胰腺炎模型
      信號通路磷酸化水平檢測芯片心肌成纖維細胞培養急性腎衰竭模型
      BioPlex懸浮芯片軟骨細胞培養體內血栓模型
      生長因子芯片血管內皮細胞培養關節炎模型
      炎癥因子芯片神經元細胞培養I型和II型糖尿病模型
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      凋亡因子芯片基因編輯動物
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      細胞原代培養mRNA測序氣相色譜GC/MS
      MTT檢測LncRNA測序液相色譜LC/MS
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      細胞周期檢測RNA-Seq測序
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      Transwell細胞遷移/侵襲16s擴增子測序Micro-CT
      流式分選Small RNA測序小動物活體成像
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      細胞劃痕實驗條件性敲除小鼠/大鼠
      細胞生物學整體實驗全基因敲除小鼠/大鼠
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      病理學檢測CRISPR/Cas9細胞敲除/敲入基因芯片
      掃描電鏡基因定點突變細胞系LncRNA芯片
      透射電鏡單基因敲除細胞系miRNA芯片
      HE染色多基因敲除細胞系mRNA芯片
      免疫組化目的基因敲入細胞系甲基化芯片(限人和小鼠來源樣本)
      Tunel(原位末端凋亡法)檢測報告基因敲入細胞系SNP芯片(限人和小鼠來源樣本)
      激光共聚焦miRNA/LncRNA敲除細胞系
      免疫熒光
      Masson染色CRISPR/Cas9動物敲除/敲入科研方案設計與SCI相關服務
      原位雜交基因敲除大鼠/小鼠科研文獻論著翻譯
      熒光原位雜交基因敲入大鼠/小鼠SCI論文翻譯潤色服務
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