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       大鼠膝關節軟骨細胞的原代培養

               大鼠膝關節軟骨細胞的原代培養                

      一、實驗動物

      SD大鼠,第三軍醫大學動物中心。

      二、主要試劑及儀器

      1、主要儀器

      電熱壓力蒸汽消毒器(XDD)

      (浙江紹興醫療器械總)

      超凈工作臺

      (蘇州凈化設備公司)

      TC2323型CO2恒溫孵箱

      (美國SHEL LAB 公司)

      0.22um纖維素濾膜

      (德國BM公司)

      細胞培養瓶及細胞培養板(Costar)

      (美國BD公司)

      光學顯微鏡(OLYMPUS CK-40)

      (日本)

      倒置顯微鏡(OLYMPUS)

      (日本)

      細胞計數板

      (上海醫用儀器廠)

      DMEM培養基

      (Gibco,美國)

      胰蛋白酶

      (Hyclone,美國)

      胎牛血清(FBS)

      (Gibco/ Hyclone,美國)

      PBS

      (中山,北京)

      青霉素和鏈霉素

      (華北制藥廠,中國)

      2、實驗主要試劑配制

       (1)PBS:用購自中山公司的PBS粉劑,每袋加ddH2O定容至1000ml,調pH7.2,高壓滅菌消毒。

      (2) DMEM細胞生長培養液:臨用前根據需要加10%胎牛血清,1%的ITS,最后按1%體積分數加入雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素),使青霉素和鏈霉素的終濃度分別為100 U/mL和100 U/mL,置于4℃冰箱保存。

      (3)抗生素:青霉素(80萬U)和鏈霉素(100萬U)在無菌操作臺內以高壓滅菌過的雙蒸水溶解(分別加入4ml滅菌水/青霉素,5ml滅菌水/鏈霉素),配制成20萬u/ml分裝,置于-20℃冰箱保存,臨用時4℃解凍,注意盡量避免反復凍融,并使培養基最終濃度為100 u/ml。

      (4)細胞凍存液:生長培養基(含20%胎牛血清)或100%胎牛血清,加入10%的DMSO混合均勻,置于4℃冰箱保存。

       三、實驗步驟

      (1)取四周齡SD大鼠,頸椎脫臼法處死后立即用75%乙醇浸泡,移入超凈工作臺內,用大頭針固定大鼠四肢于工作臺面的泡沫板上。

      (2)碘酒擦拭四肢,再用酒精棉球擦拭,無菌條件下用滅菌消毒后的鑷子和剪刀分離大腿腿骨,盡可能去除筋膜、肌肉和結締組織;從關節處分離出軟骨組織,將其剪成小于1mm3的組織塊,用含雙抗的PBS溶液沖洗兩遍。

      (3)軟骨組織塊靜置5min,棄去上層液體及懸浮組織,往離心管中加3倍體積的0.25%胰蛋白酶,置入37℃的恒溫搖床中,振蕩消化15-20min;

      (4) 4℃靜置5min;棄上清,加入0.2%膠原酶II,置入37℃的恒溫搖床中,振蕩消化30~60min;
      (5)加入生長培養基終止消化,反復吹打后依次通過200目濾網。收集濾液,1200rpm離心8min,棄上清,用DMEM完全培養基重新懸浮細胞, 放入37℃,5%CO2細胞培養箱中培養;

      (7)放入預置有薄骨片或蓋玻片的培養板中進行培養。每3天更換培養液至第5天改為無血清培養液。免疫組化鑒定原代細胞。

      四、細胞形態

      膝關節軟骨原代培養過程中,約24小時即可出現貼壁生長,細胞三角或多角形,生長緩慢,培養3-5天進入快速增殖期。

      五、注意事項:

      細胞培養一定要保持工作區的無菌清潔,先用紫外燈和臭氧殺菌1h,然后通風30min,操作前需要換細胞間專用拖鞋,雙手帶上一次性橡膠手套并用75%乙醇消毒,穿上實驗服,戴上一次性口罩和帽子,整個無菌操作都應該在酒精燈的周圍進行。

      六、服務流程:



      威斯騰生物服務項目


      分子生物學檢測蛋白質與免疫學動物實驗
      實時熒光定量PCR單克隆抗體制備帕金森疾病模型
      免疫共沉淀(Co-IP)多克隆抗體制備抑郁癥動物模型
      ELISA(酶聯免疫吸附法)技術Western-blot 實驗服務脊髓損傷模型
      生化指標檢測蛋白雙向電泳實驗服務腦外損傷模型
      雙熒光素酶報告基因檢測原核蛋白表達純化骨神經損傷模型
      染色質免疫共沉淀(ChIP)真核蛋白表達純化心肌缺血模型
      GST pull DownITRAQ定量蛋白質組學心力衰竭模型
      SLAC蛋白組學肺動脈高血壓動物模型
      高血壓模型
      病毒包裝純化實驗課題整體外包粥樣動脈硬化模型
      過表達/干擾慢病毒包裝純化整體課題外包大腦中動脈阻塞模型
      過表達/干擾腺病毒包裝純化細胞整體實驗外包慢性之氣管炎模型
      逆轉錄病毒包裝純化動物整體實驗外包過敏性哮喘模型
      腺相關病毒包裝純化肺炎大鼠模型
      肝炎-肝硬化-肝癌模型
      蛋白芯片原代細胞培養肝纖維化模型
      細胞因子芯片骨髓間充質干細胞培養膽結石模型
      生長因子芯片脂肪干細胞培養急性胰腺炎模型
      信號通路磷酸化水平檢測芯片心肌成纖維細胞培養急性腎衰竭模型
      BioPlex懸浮芯片軟骨細胞培養體內血栓模型
      生長因子芯片血管內皮細胞培養關節炎模型
      炎癥因子芯片神經元細胞培養I型和II型糖尿病模型
      血管生成因子芯片內皮組細胞原代培養裸鼠成瘤
      凋亡因子芯片基因編輯動物
      趨化因子芯片電生理相關服務動物整體實驗服務
      HuProt TM 20K人類蛋白組芯片膜片鉗實驗
      細胞生物學高通量測序代謝組學
      細胞原代培養mRNA測序氣相色譜GC/MS
      MTT檢測LncRNA測序液相色譜LC/MS
      細胞凋亡檢測全基因組測序核磁共震NMR
      細胞周期檢測RNA-Seq測序
      細胞克隆形成實驗外顯子測序影像學相關實驗
      Transwell細胞遷移/侵襲16s擴增子測序Micro-CT
      流式分選Small RNA測序小動物活體成像
      CCK8/XTT檢測宏基因組測序核磁共振
      臺盼藍檢測細胞活性單細胞測序PET-CT
      藥物篩選細胞學實驗circleRNA測序
      細胞粘附性檢測甲基化測序基因編輯動物
      細胞劃痕實驗條件性敲除小鼠/大鼠
      細胞生物學整體實驗全基因敲除小鼠/大鼠
      細胞成管實驗
      病理學檢測CRISPR/Cas9細胞敲除/敲入基因芯片
      掃描電鏡基因定點突變細胞系LncRNA芯片
      透射電鏡單基因敲除細胞系miRNA芯片
      HE染色多基因敲除細胞系mRNA芯片
      免疫組化目的基因敲入細胞系甲基化芯片(限人和小鼠來源樣本)
      Tunel(原位末端凋亡法)檢測報告基因敲入細胞系SNP芯片(限人和小鼠來源樣本)
      激光共聚焦miRNA/LncRNA敲除細胞系
      免疫熒光
      Masson染色CRISPR/Cas9動物敲除/敲入科研方案設計與SCI相關服務
      原位雜交基因敲除大鼠/小鼠科研文獻論著翻譯
      熒光原位雜交基因敲入大鼠/小鼠SCI論文翻譯潤色服務
      特殊染色(PSA、茜素紅、阿爾新藍等)臨床實驗/科研實驗設計方案指導
      行為學檢測藥物篩選服務項目藥效學評價
      水迷宮實驗高通量自動藥物篩選平臺神經系統藥物藥效學評價
      曠場實驗細胞高內涵藥物篩選平臺抗腫瘤藥物藥效學評價
      重復性刻板行為檢測蛋白質組學靶標研發平臺心血管系統藥物藥效學評價
      動物跑臺檢測分子藥理研究平臺泌尿系統藥物藥效學評價
      強迫游泳生物膜片鉗藥物篩選平臺內分泌系統藥物藥效學評價
      常規藥物體外篩選抗炎免疫藥物藥效學評價

       

      【本平臺合作項目】

      分子生物學、細胞生物學、病理染色檢測、細胞敲除&敲入、模式與轉基因動物、SPF動物保種、免疫學檢測、影像學檢測、原代培養、細胞藥篩、CRISPR/Cas9基因編輯、基因芯片、高通量測序、蛋白組學、代謝組學、高通量高內涵篩選、藥效學評價、藥理毒理學實驗、慢病毒包裝與穩轉株建立、SiRNA與納米載藥、ChIP、CO-IP、生物信息學分析、知識產權服務!

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